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石蜡切片免疫组化染色步骤

更新时间:2013-01-22 09:34:13点击次数:2472次字号:T|T
1、载玻片的处理: 抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常 进行,可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种 试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下: 1.1 APES:现用现配。将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中,停留 20~30 秒钟,取出 稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结...
1、载玻片的处理:
抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常
进行,可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip
TM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种
试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下:
1.1 APES:现用现配。将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中,停留 20~30 秒钟,取出
稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的 APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片
时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。
1.2 Histogrip
TM:将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中,停留 1~2 分钟,然后用双
蒸水快速清洗三次,室温干燥或 60
oC 烤箱烘烤一小时,装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡
5 分钟,60
oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化:
2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为 0.05%~0.1%,消化时间为 37℃、10~40 分钟,主要用于细胞内抗原的
显示。
2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为 0.4%,消化时间为 37℃、30~180 分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,
如:Laminin(层粘蛋白),Collagen IV(IV 型胶原)等。
2.3 皂素(Saponin):一般使用浓度为 2~10m g/ml 的 saponin 溶液,消化时间为室温孵育 30 分钟。
3、抗原热修复:
可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热
修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)
效果最好。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一包溶于 1000ml
的蒸馏水中,混匀,其 pH 值在 6.0 ± 0.1,如因蒸馏水本身造成的 pH 值偏差,请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理 10 分钟,蒸馏水洗 2 分钟×
3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在
92℃~98℃之间并持续 10~15 分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置
条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器,室温冷却 10~20 分钟(注意:不可将
切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS 洗,下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将 1500ml~3000ml 的枸橼酸盐缓冲液(工作液)
注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。
当压力锅开始慢慢喷气时(约加热 5~6 分钟后),计时 1~2 分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至
室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS 洗 2 分钟×3,下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的
容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到 达
92℃~98℃起开始计时 15~20 分钟,然后端离电炉,室温冷却 20~30 分钟,蒸馏水冲洗,PBS 洗,下
接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤:
(以美国 ZYMED 公司 SP 试剂盒为例)
4.1 石蜡切片脱蜡至水。
4.2 3%H2O2 室温孵育 5~10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。
4.3 蒸馏水冲洗,PBS 浸泡 5 分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)。4.4 5~10%正常山羊血清(PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀
释的一抗或一抗工作液,37℃孵育 1~2 小时或 4℃过夜。
4.5 PBS 冲洗,5 分钟×3 次。
4.6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS 稀释),37℃孵育 10~30 分钟;或滴加第二代
生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育 10~30 分钟。
4.7 PBS 冲洗,5 分钟×3 次。
4.8 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释),37℃孵育 10~30 分钟;或第二代辣根
酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育 10~30 分钟。
4.9 PBS 冲洗,5 分钟×3 次。
4.10 显色剂显色(DAB 或 AEC)。
4.11 自来水充分冲洗,复染,封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片 4~8µm,室温放置 30 分钟后,入 4℃丙酮固定 10 分钟,PBS 洗,5 分钟×3。用 3%过氧化
氢孵育 5~10 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗,5 分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。

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