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PHAGOBURST试剂盒使用说明

更新时间:2013-02-01 14:59:24点击次数:3456次字号:T|T
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1.       试剂盒简介

PHAGOBURST试剂盒,用于定量检测全血中白细胞氧化爆发功能。试剂盒中包括未标记的调理大肠杆菌,PMAfMLP作为刺激物(可三选一进行实验),DHR123作为荧光底物。样本经过刺激物的刺激后,吞噬细胞在氧化爆发过程产生的氧化物可将DHR123转化为R 123。采用流式细胞仪检测产生氧化反应产物的吞噬细胞百分比和酶活力(每个细胞含有的R 123的量)。

试剂盒可以考察药物是否引起机体细胞氧化爆发活性改变。氧爆活性的降低或者缺失在慢性肉芽肿病(白细胞功能缺陷)中可以被观察到。另外,氧爆活性的降低还可以在AIDS病人,老年人,发生严重感染的病人,采用已酰半胱氨酸进行治疗的病人,或者骨髓移植,输血的病人被观察到。

试剂盒不仅适用于人的血样,同样也适用于大小鼠,兔,狗,牛及其他种属。

2.       材料和试剂

2.1 试剂盒包括以下试剂

REAG A( 试剂A)

1x洗液:将1整瓶REAG A粉末溶解在1L的双蒸水中。

REAG B(试剂B

1瓶(2mL),1x浓度的稳定且未标记的调理大肠杆菌(E.coli),大约为1-2x109个菌/mL

REAG C(试剂C

1瓶(100 μL)chemotactic petide fMLP (200x储备液浓度,1mM)。每5 μL加在1mL的 1x洗液中进行稀释。

REAG D(试剂D

1瓶(100 μL) phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  (200x储备液浓度,1.62 mM)。每5 μL加在1mL 1x洗液中进行稀释。

REAG E(试剂E

共有12瓶基质试剂。每瓶内有1片含dihydrorhodamine 123(DHR123)的基质片,使用前20-30 min用1mL的 1x洗液进行溶解。

REAG F(试剂F

1瓶(20 mL)的裂解液(10x储备液浓度)。在使用前用双蒸水按1:10进行稀释,配制成1x的裂解液,用于裂解红细胞和固定白细胞。

REAG G(试剂G

1瓶(20 mL),1x浓度的DNA染液(粉色溶液),用于流式细胞仪分析时区别细菌和白细胞。

 

储存条件和稳定性:试剂盒需要在2-8℃避光条件。使用前将大肠杆菌(REAG B)充分涡旋混匀或者用针抽吸使其分散。fFMLP和PMA的工作溶液在使用后即弃。试剂内含有防腐剂,但是不会影响氧化爆发活性的检测。试剂的有效期同试剂盒包装上标明一致。

2.2    试剂盒未包括以下材料,但需要准备

l  血液采集用的肝素化抗凝管。

12x75 mm的一次性试管(BD公司的Falcon管,货号:352052)和合适数量的试管架。

500 mL1000 mL的试剂瓶,用于保存1x洗液和1x裂解液。

l  带盖的冰浴盒。

l  双蒸水或者注射用水,用于配制1x洗液和1x裂解液。

l  合适量程的移液器(20-200 μL, 100-1000 μL),一次性枪头。

l  连续加样器和枪头。

l  水浴锅。

l  数字式温度计。

l  涡旋器

l  冷冻离心机(配有12x75 mm的吊杯)。

488 nm激发波长(氩离子激光)的流式细胞仪。

3.       操作过程

2.1 准备

l  配制1x洗液。

l  根据需要按比例配制试剂C fMLP)或者试剂D PMA

l  根据测试的样本量配制1x裂解液(试剂F, 2mL/测试样。

l  在使用基质溶液(试剂E)的20-30 min前对其进行配制,加入1mL 1x洗液后轻轻摇匀,勿涡旋振荡。配制后未使用的基质溶液可在小于-15℃的条件下保存2周。

l  准备冰浴。

l  预热水浴锅至37,温度必须精确控制!

l  开启流式细胞仪,用校准微球(beads)进行校准。

3.2    样本处理

3.2.1          加样

将肝素化抗凝的全血涡旋混匀后,在5 mL试管(Falcon管)底部各加100 μL全血,将所有试管放入冰浴中10 min,使血样降低温度至0

注意:勿将血液残留在试管壁上。不要使用EDTA或者柠檬酸抗凝管采集全血。

3.2.2          激活

l  在tube#1 中加入20 μL的1x洗液(REAG A),标记为“阴性对照”管。

l  在tube#2中加入20 μL预冷后涡旋混匀的大肠杆菌(REAG B)。

l  在tube#3 中加入20 μL的fMLP稀释后的工作溶液(REAG C),标记为“低刺激对照”管。

l  在tube#4 中加入20 μL的PMA稀释后的工作溶液(REAG D),标记为“高刺激对照”管。

l  所有试管再次混匀后,置于37°C水浴内孵育10 min。孵育时间和温度必须严格监控,水浴箱必须盖住

3.2.3          氧化

每支试管中均加入20 μL 基质溶液(REAG E),彻底涡旋混匀,在37°C水浴箱内孵育10 min。

3.2.4          裂解和固定

每支试管加入2 mL预热至室温的1x 裂解液(REAG F),涡旋混匀,室温避光孵育20 min。离心(5 min,250xg,2-8°C),去除上清液。

3.2.5          洗涤

每支试管加入3 mL 1x洗液(REAG A),涡旋混匀,离心细胞(5 min,250xg,2-8°C)。去除上清液。

3.2.6          DNA染色

每支试管加入200 μL DNA染液(REAG G),混匀,避光冰浴10 min后,在30 min内完成流式细胞仪分析。

4.       流式细胞仪分析

采用蓝绿激发光的488nm的氩离子激光器。

l  设定1gateFL2的直方图(红色荧光),圈定含有人类二倍体细胞相同DNA的细胞群(用于排除细菌,见英文原版图Fig. A

每个样本收集10,000-15,000 白细胞。

l  数据评估

通过细胞产生氧化代谢产物的平均荧光强度进行分析。在散点图 lin FSC/lin SSC中圈定所要检测细胞群(粒细胞,单核细胞),见英文原版图Fig.2A-2F

阴性对照管(tube#1)在FL1坐标轴上设定maker,使1~3%的细胞在阳性区域。

测试管(tube#2/3/4)在marker内的细胞则为的阳性细胞,平均荧光强度和发生氧化的量相关。

5.       注意事项(Remarks

l  肝素化抗凝的全血需要在采集后24 h进行处理,在处理前在室温条件下保存。

l  可获得基质的量与基质片溶解在1x洗液中的孵育时间是相关的(20-30 min最佳)。

l  嗜酸性粒细胞(过敏及寄生虫感染时数量增多)会显示自体荧光增长,在0°C的阴性对照分析时会被显示出来。

l  吞噬细胞在37°C的大小和颗粒度会与阴性对照的样本不同,这一点在圈定细胞区域的时候要注意。另外,细胞可能会由于在37°C条件下的自体溶解或者粘附在塑料表面而丢失减少。

l  在建立试验方法时,采用重复管是非常有用的。

l  提供的采用大肠杆菌的试验方法是在最佳条件下(如,全血样本,调理的大肠杆菌等)考察样本的氧化爆发活性。在正常人体给药后进行体内或者体外氧化爆发活性检测时通常只有一定程度增加。

进行体外试验检测药物作用时,通常可选择低刺激物fMLP或者进行时间依赖性动力学试验(与大肠杆菌孵育2.5或者5 min)或者稀释菌液(1:4或者1:8)

l  大肠杆菌已经受调理素的作用过的,但是全血中的血清还会对其有一定的影响。所以当采用除全血样本以外的样本,如分离的单核细胞,巨噬细胞或者其他细胞系与大肠杆菌孵育时,孵育体系可加入5-20% 胎牛血清或者人血清。同时也可能有必要延长孵育时间(60 min-240 min)。

6.       其他限制(Limitations

l  每个实验室需要根据自己实验条件建立的自己的参考值范围。

l  样本需要至少有95%的活细胞且全血样本需要完全被抗凝。含有衰老的细胞和未完全抗凝的血样可能导致非特异染色,可能是由于血小板的凝集和死细胞的泄漏的DNA引起的。

l  样本在未加入DNA染液(REAG G)上流式细胞仪检测前,在冰上放置1 h是稳定的,但是荧光强度会系统性的丢失。

l  基质DHR123非常容易氧化,所以是在安瓿瓶(含有惰性气体)存放。

7.       关于进行定量分析的重要的说明(important instruction for quantitative analysis

l  吞噬作用和氧化爆发是主要依赖于温度,所以在整个样本处理过程中样本的温度,孵育条件的温度是需要严格遵守。温度计应采用可以显示小数点后一位的型号。

l  实验的可重复性和标准化操作是非常重要的,所以需要严格按照试剂说明书和自己改动步骤(如果有改动)进行操作。

l  任何流式细胞仪的改动都要考虑,因为这会影响到“Geomean”的值,所以使用校准微球(beads)对流式细胞仪进行每日的校准是非常有必要的。


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