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gene bridges快速简易BAC修饰工具包

更新时间:2013-03-28 09:16:31点击次数:4359次字号:T|T
快速简易BAC修饰工具包 适用于所有类型的BAC修饰。 手册[PDF]    联系技术支持             订单            序列 特点         

快速简易BAC修饰工具包

适用于所有类型的BAC修饰。

手册[PDF]    联系技术支持             订单            序列

特点

          快速、可靠克隆大型DNA分子

          在选择的位置进行精确的DNA修饰

          独立限制性位点

          无大小限制

应用

          简单的BAC修饰,如插入选择标记、删除带有选择标记基因的片段、插入功能片段和选择标记基因等。

一步插入选择标记基因综述

1.Red/ET BAC转化
第一步,Red/ET质粒pSC101-BAD-gbaA转入包含BAC的大肠杆菌宿主。


2. Red/ET BAC修饰


通过添加阿拉伯糖,温度变化保持在30°C至37°C,可诱导介导Red/ET的基因表达。在诱导完成后,细胞为电穿孔做好准备,添加有同源臂的PCR产品进行电穿孔。


3. 修饰后BACDNA选择及提取

选择由PCR产品中可选标记运送的抗生素抗性,以识别携带修饰成功的BAC的菌落。之后进行DNA微量制备,用于确认是否实现需要的BAC修饰。

说明

本工具包使用创新Red/ET重组技术修饰BAC。该技术可以在2周内对任意类型BAC进行插入和删除。
Red/ET重组采用体内重组与校正活性来将构筑中的多余突变最小化。工具包内含修饰BAC的必需物和进行对照试验所需的全部材料,旨在让您熟悉这一新技术。

另外,本工具包还提供可将任意大肠杆菌株转化为用于Red/ET重组应用的菌株的载体。pSC101-BAD-gbaAtet与四环素抗性盒一起提供。本盒包含一个仅能在30°C繁殖的温度敏感型复制起点(ori),在37°C时质粒就会消失。这样,当不再需要时,就可以进行简单的质粒消除。

要引入突变(如本工具包所含新霉素抗性盒这样的选择盒),您首先需要将同源序列引入选择盒。这可以通过简单的PCR反应完成。
您可以自由选择这些短同源序列(每个50nt)用于实验。您只需选择修饰位置,直接使用Red/ET重组技术在目标核苷插入选择盒。PCR产品需要在细菌中使用Red/ET重组系统进行电穿孔。
在Red/ET重组成功后,修饰后的DNA可以使用传统DNA微量制备方法恢复。

目录

          pSC101-BAD-gbaA(tet)是基于pSC101 ori(温度敏感型起点)的Red/ET表达质粒的衍生物。

          BAC宿主携带pSC101-BAD-gbaA(tet)

          修饰150kb BAC的阳性对照实验(携带pSC101-BAD-gbaA的宿主中的BAC克隆,用于BAC骨干中删除的neo PCR产品,宿主中作为阳性重组体的BAC-neo克隆)

          操作指南,质粒、遗传图和寡核苷酸序列的说明


序列

Tn5-kanR/neoR selection cassette 选择盒

Tn5-kanR/neoR选择盒


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