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gene bridges反选择BAC修饰工具包

更新时间:2013-03-28 09:23:33点击次数:3367次字号:T|T
反选择BAC修饰工具包 使用反选择盒进行高级BAC修饰,同样适用于细菌染色体。 手册[PDF]    联系技术支持            订单           序列 特点      &n

反选择BAC修饰工具包

使用反选择盒进行高级BAC修饰,同样适用于细菌染色体。

手册[PDF]    联系技术支持            订单           序列

特点

          快速BAC修饰(2-3周)

          高效Red/ET重组

          Red/ET质粒易于消除

          效率远高于pScB-neo系统

应用

          片段交换

          无需留下选择标记或任意多余序列,即可进行标记插入和删除。

          引入短序列,如点突变、loxP位点、限制性位点等。

          同样适用于细菌染色体修饰及普通ColE 1起点质粒

非选择基因的两步交换综述

1.    Red/ET转化BAC宿主

第一步,Red/ET质粒pSC101-BAD-gbaA转入含BAC的大肠杆菌宿主。

2.Red/ET第一步
通过添加阿拉伯糖,保持温度变化在30°C37°C之间,可诱导介导Red/ET的基因表达。诱导后,细胞为电穿孔做好准备,添加同源臂的PCR产品(rpsL-neo PCR产品反选择/选择盒)电穿孔。

3.修饰后BAC DNA的选择及提取

选择携带修饰后BAC的克隆。只有携带修饰成功的BAC的克隆才能通过琼脂板上的卡那霉素选择。之后进行DNA微量制备,用于确认反选择/选择盒的成功融合。

4. Red/ET第二步
通过添加阿拉伯糖,保持温度变化在30°C37°C之间,可诱导介导Red/ET的基因表达。诱导后,细胞为电穿孔做好准备。非选择DNA既可以是含选择盒左右同源臂及点突变的寡核苷酸(对照反应),也可以是侧带同源臂的基因,将被电穿孔。rpsL-neo反选择/选择盒将被非选择DNA替换。

5.无反选择/选择盒的选择

只有选择/反选择盒被非选择DNA片段替换的克隆才会在链霉素板上生长。随后DNA微量制备,用于确认反选择/选择盒的成功融合。

说明

这是基于链霉素选择的新版反选择盒pRpsL-neo。本工具包用于在2-3周内使用反选择盒修饰任意类型的细菌人造染色体(BAC)。内含反选择盒pRpsL-neo基于链霉素选择,表现出远高于pSacB-neo或其他可比系统的效率。

工具包也可用于操作细菌染色体核普通ColE 1起点质粒。本工具包Red/ET效率高,重组完成后Red/ET重组蛋白表达质粒pRedET易于消除。

目录

          Red/ET重组蛋白表达质粒pRedET。通过该质粒转化,任意大肠杆菌株都可作为Red/ET专用

          已携带Red/ET质粒的BAC宿主大肠杆菌株DH10B

          用于您自己实验的pRpsL-新霉素模板

          阳性对照,在150kb BAC中引入点突变

          详细操作指南,质粒、遗传图、序列说明

           

序列

rpsL-kanR/neoR selection cassette选择盒

rpsL-kanR/neoR选择盒

 


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